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本试剂盒适用于从细菌/组织细胞快速提取总RNA，基于无苯酚、氯仿RNA快速提取技术，增加了基因组DNA清除柱，确保有效清除gDNA残留，得到的RNA不需要DNase消化，可直接用于反转录PCR、荧光定量PCR等实验。独特的裂解液迅速裂解细胞和灭活细胞RNA酶，然后裂解混合物通过一个基因组DNA清除柱，基因组DNA被清除而RNA穿透滤过。滤过的RNA用乙醇调节结合条件后，RNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤，去蛋白液和漂洗液将细胞代谢物，蛋白等杂质去除，最后低盐的RNase free H2O将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。

• 完全不使用有毒的苯酚，氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。
  
• 快速，简捷，单个样品操作一般可在30分钟内完成。
  
• 基因组DNA清除柱技术确保有效清除gDNA残留，得到的RNA不需要DNase消化，可直接用于反转录PCR、荧光定量PCR等实验。
  
• 多次柱漂洗确保高纯度，OD260/OD280典型的比值达2.0～2.2，基本无DNA残留，可用于RT-PCR，Northern-blot和各种实验。

• 所有的溶液应该是澄清的，如果环境温度低时溶液可能形成沉淀，此时不应该直接使用，可在37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清。
  
• 不合适的储存于低温（4℃或-20℃）会造成溶液沉淀，影响使用效果，因此运输和储存均在室温下（15～25℃）进行。
  
• 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

• 所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13000rpm的传统台式离心机。
  
• 所样品处理量绝对不要超过基因组吸附柱DA和和RNA吸附柱RA处理能力，否则造成DNA残留或产量降低。开始摸索实验条件时，如果不清楚样品DNA/RNA含量时宁可使用较少的样品处理量，将来根据样品试验情况增加或者减少处理量。
  
• 裂解液RLT Plus和去蛋白液RW1中含有盐酸胍/异硫氰酸胍化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。
  
• 关于DNA的微量残留：
  一般说来任何总RNA提取试剂在提取过程中无法完全避免DNA的微量残留，本试剂盒采用了独特的缓冲体系和选择了特殊吸附能力的吸附膜，在大多数RT-PCR扩增过程中极其微量的DNA残留（一般电泳EB染色紫外灯下观察不可见）影响不是很大，如果要进行严格的mRNA表达量分析如荧光定量PCR，我们建议在进行模板和引物的选择时：
  
  • 选用跨内含子的引物，以穿过mRNA中的连接，这样DNA就不能作为模板参与扩增反应。
    
  • 选择基因组DNA和cDNA上扩增的产物大小不一样的引物对。
    
  • 将RNA提取物用RNase-free的DNase I处理以提高效果。本试剂盒还可以用于DNase I处理后的RNA清洁，请联系我们索取具体操作说明书。
    
  • 在步骤去蛋白液RW1漂洗前，直接在吸附柱RA上进行DNase I处理。请联系我们索取具体操作说明书（微量DNA柱式吸附清除试剂盒）。
• RNA纯度及浓度检测：
  
  • 完整性： RNA可用普通琼脂糖凝胶电泳(电泳条件：胶浓度1.2%；0.5×TBE电泳缓冲液；150V，15分钟)检测完整性。由于细菌中70%～80%的RNA为rRNA，电泳后UV下应能看到非常明显的rRNA条带。细菌rRNA大小分别约为5kb和2kb，分别相当于26S和13S rRNA。细菌RNA样品中最大rRNA亮度应为次大rRNA亮度的1.5～2.0倍，否则表示RNA样品的降解。出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。
    
  • 纯度：OD260/OD280比值是衡量蛋白质污染程度的参考指标。高质量的RNA，OD260/OD280读数（10mM Tris,pH7.5）在2.1～2.2之间（100%纯的RNA比值一般是2.2左右，很多公司无法达到这个标准，所以1.9-2.0就凑合使用了，但是我们的产品标准一般可以达到2.1～2.2）。
    
  • 浓度：取一定量的RNA提取物，用RNase-free水稀释n倍，用RNase-free水将分光光度计调零，取稀释液进行OD260、OD280测定，按照以下公式进行RNA浓度的计算：终浓度（ng/μL）= (OD260)×(稀释倍数n)×40。
• 本试剂盒也可以提取组织细胞RNA，具体步骤可以参考组织细胞总RNA提取试剂盒(去除gDNA)进行。

• 第一次使用前请先在漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中按照标签加入指定量无水乙醇!
  
• 提取细菌RNA需先配制加了溶菌酶或者lysostaphin的TE(10mM Tris-HCl，1mM EDTA)，TE中已加入溶菌酶或者lysostaphin，浓度为1mg/mL。

• 离心收集1～2mL菌液(10⁸～10⁹细胞)到一个1.5mL离心管，尽可能去除上清，注意残留的上清不能超过20μL/每使用100μL TE(见下面步骤2)。
  
• 根据细胞的种类和数量，充分重悬细胞在100μL(5×10⁸细胞)/200μL(5～7.5×10⁸细胞) TE中(10mM Tris-HCl,1mM EDTA)，TE中已加入溶菌酶或者lysostaphin，浓度为1mg/mL，或者直接用TE重悬后，用干净枪头挑取少许溶菌酶加入。
  
• 室温(15～25℃)温育5分钟/溶菌酶，或者37℃温育15分钟/lysostaphin，破解细胞壁。每2分钟涡旋振荡10秒帮助破壁。
  
  • 各种细菌破壁的难易程度不一样，一般革兰氏阴性菌E.coli使用上面的条件就足够了，，甚至可能省略该步骤，但是某些革兰氏阳性菌如B.subtilis难破壁需要提高溶菌酶浓度到15mg/mL和温育时间到10分钟。如果金黄色葡萄球菌需要加入lysostaphin到1mg/mL，37℃温育15分钟。总之不同细菌类型破壁难易程度不同，有的难破壁的种类需要根据用户自己的具体情况调节酶的种类、工作浓度和温育温度、时间，此外还可以联合使用玻璃珠击打，机械破壁，蛋白酶K消化等方法帮助破壁。
• 短暂离心1分钟收集细胞到管底，吸弃上清。涡旋振荡重悬分散细胞。
  
• 加入500μL裂解液RLT Plus，吹打混匀后剧烈振荡20秒，充分裂解。
  
  • 一般加入裂解液后充分涡旋吹打后应该见不到明显团块或者不溶物，极少数情况下如果有明显团块或者不溶物可以将裂解物13000rpm离心3分钟，沉淀不能裂解的碎片或者不溶物，将裂解物上清全部转到一个新离心管再进行下一步。
• 立刻将裂解物加入一个DNA清除柱上（清除柱放在收集管内）13000rpm离心30秒，保留滤过液（RNA在滤过液中）。
  
  • 确保离心后液体全部滤过去，膜上没有残留，如有必要，可以加大离心力和离心时间。
• 用微量移液器较精确估计滤过液体积（通常为500μL，滤过时候损失体积应该减去），加入等体积的70%乙醇（请先检查是否已加入无水乙醇!），此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。
  
• 立刻将混合物(每次小于700μL，多可以分两次加入)加入一个吸附柱RA中，（吸附柱放入收集管中）13000rpm离心30秒，弃掉废液。
  
• 加700μL去蛋白液RW1，室温放置30秒，13000rpm离心30秒，弃掉废液。
  
• 加入500μL漂洗液RW（请先检查是否已加入无水乙醇!），13000rpm离心30秒，弃掉废液。加入500μL漂洗液RW，重复一遍。
  
• 将吸附柱RA放回空收集管中，13000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
  
• 取出吸附柱RA，放入一个RNase free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30～50μL RNase free H2O，室温放置1分钟，13000rpm离心1分钟。
  
  • 洗脱缓冲液体积不应少于30μL，体积过小影响回收效率。如果需要得到更大浓度的RNA，将离心得到的RNA溶液加回到吸附柱重复洗脱一遍。